La PCR
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La PCR
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La reazione a catena della polimerasi o PCR (Polymerase Chain Reaction) Una nuova procedura denominata reazione a catena della polimerasi (PCR) può replicare selettivamente e ripetutamente frammenti selezionati da una miscela complessa di DNA. Questa possibilità di amplificare sequenze rare presenti in una miscela ha enormemente aumentato la sensibilità dei test genetici. In una applicazione tipica della PCR, il DNA estratto viene frammentato mediante l'impiego di un enzima di restrizione e quindi denaturato a singolo filamento. Vengono poi preparate sonde oligonucleotidiche (i primers) complementari all'estremità 3' del segmento di DNA da amplificare. La sonda è aggiunta in grande eccesso al DNA denaturato ad una temperatura compresa fra 50°C e 60°C. Il campione di DNA genomico totale, che è ad una bassa concentrazione, rimane denaturato ma la specifica sonda oligonucleotidica si ibrida in corrispondenza del relativo sito sul DNA. La sonda ibridata serve poi come innesco per la sintesi di una catena di DNA che comincia quando vengono aggiunti desossinucleotidi e una DNA polimerasi termoresistente ottenuta dal Thermophilus aquaticus (un batterio che vive nelle sorgenti di acque termali). Questo enzima (denominato Taq polimerasi) può operare l'estensione dell'innesco a temperature elevate (oltre 72°C). quando la sintesi è completata, l'intera miscela viene ulteriormente riscaldata (a 95°C) per fondere i duplex di DNA neoformati. Quando la temperatura viene di nuovo abbassata, un altro ciclo di sintesi può avere luogo in quanto l'innesco è ancora presente in eccesso. Questo ciclo di sintesi e di fusione può essere ripetuto per amplificare la sequenza che interessa. A ogni ciclo, il numero delle coppie della sequenza compresa fra i siti di innesco si raddoppia e perciò la sequenza desiderata aumenta in maniera esponenziale.
La reazione a catena della polimerasi permette che specifiche regioni di DNA provenienti da un piccolissimo campione possano essere esaminate velocemente. La PCR è entrata ormai nell'uso comune come procedura diagnostica nella genetica umana. Nella ricerca di base, la PCR permette invece il recupero di intere sequenze comprese tra ogni due estremità a sequenza nota.
PCR: schema Fase 1: il segmento di DNA viene riscaldato a 95°C, separando i due filamenti della doppia elica.
Fase 2: la temperatura viene raffreddata a 55°C e vengono aggiunte le sonde oligonucleoditiche alla soluzione. Le sonde marcano i bordi del segmento di DNA da duplicare.
Fase 3: viene aggiunta la polimerasi alla soluzione. La polimerasi agisce aggiungendo le basi speculari corrispondenti ai due filamenti di DNA, creando come risultato due segmenti identici di DNA.
Fase 4: il processo viene ripetuto, duplicando ogni volta il numero di segmenti di DNA nella soluzione. Dopo trenta ripetizioni, possono essere fatte oltre un milione di copie del segmento di DNA.
E’ necessario sottolineare infine che la PCR è utile per lo studio di poche coppie di basi azotate (dalle 100 alle 1000, contro i 2 miliardi di basi presenti nel DNA umano). Per studiare frammenti di DNA di lunghezza maggiore o minore si utilizzano altri metodi che esulano dal nostro discorso. |
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